肠道菌群稳态与结直肠癌研究进展

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是全球第三大常见癌症，每年新发病例约为136万，近70万例死亡[1]。目前，明确的引发CRC的危险因素首先是缺乏锻炼、吸烟、过量食用红肉和加工肉以及饮酒等不健康的行为。相较于小肠，大肠中细菌密度最大(大肠细菌1012 个/mL对比小肠104个/mL)，CRC的发生也可受肠道菌群的影响。在过去的几十年中，很多研究发现了肠道菌群对CRC发展的作用机制，对肠道菌群进行深入研究成为预防和治疗CRC的一个重要途径。由于菌群组分在个体之间差异极大且高度依赖于生活方式、饮食和个体基因型，所以对脂质代谢、维持肠道稳态或者致癌作用的机制也不尽相同。结直肠中有10 万亿～100万亿个共生菌参与代谢食物、消化分泌物以及脱落的结肠细胞，菌群在人体内发挥着巨大的作用，对人类健康产生深远的影响。菌群与自生或与其他菌群甚至与周围微环境中的物质进行着复杂的相互作用。此文将重点介绍肠道菌群的重要作用，尤其是菌群与肠道稳态及诱发癌症的重要作用。

1 肠道菌群与肠道稳态

1.1 物质代谢

据统计，超过1 000种细菌共生在人体肠道中。尽管这些菌群在肠道中具有一定稳定性，但它们之间的比例会随着时间的推移和个体之间的差异发生很大变化。在单个个体中，菌群的数量和组成也存在空间变异性，研究发现，胃和十二指肠内容物中细菌约有10～103 个/g，小肠约为104～107 个/g，大肠内容物中的细菌接近1011～1012 个/g[2]。肠道菌群在人体代谢中为宿主提供重要的代谢物，如促使膳食碳水化合物中的简单糖类转化为有机酸如短链脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)，并使其发酵产生气体。可产生丁酸盐的细菌，能将有机酸转化为对宿主有益的SCFAs，为结肠细胞提供能量[3]，增强肠屏障功能和减少氧化应激反应等[4]。肠道内的脂质可以来自肠本身，也可来自脱落的上皮细胞甚至来自细菌[5]。内源性胆固醇及其他脂类代谢的胆汁酸中仅有5%到达结肠，被细菌代谢成二级胆汁酸，肠源性败血症就是拟杆菌将初级胆汁酸解离和脱水转化为结肠中的二级胆汁酸(脱氧胆酸和石胆酸)形成的具有致癌作用的病理反应，许多细菌具有蛋白酶活性，可以将蛋白质水解成小肽继而被菌群代谢为氨基酸，从而成为其他细菌的能量来源或氮源[6]。

1.2 肠黏膜屏障维持

肠上皮的主要功能是形成屏障，保护肠道免受外部环境的影响，以调节来自内腔的营养物、电解质和水分，并维持菌群环境与宿主之间的稳态。肠黏膜和上皮细胞的紧密连接共同形成肠上皮的保护功能，有报道提示肠黏膜会在无菌小鼠肠道中发育不良，从而对葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎具有高度易感性[7]。此外，通过肠道菌群产生的SCFAs可以通过上调紧密连接蛋白Claudin-1和ZO-1的表达来降低通透性，从而起到肠屏障的保护作用[8]。无菌动物由于紧密连接蛋白和黏液蛋白的低表达，易发生肠屏障受损。因此菌群在保护肠道完整性方面起到重要作用。

1.3 肠道免疫调节

肠道菌群通过先天性免疫成分对黏膜及全身免疫系统起调控作用。固有免疫细胞中，巨噬细胞活化后具备吞噬侵入性细菌的能力，并产生抗炎细胞因子IL-10维持肠内稳态[9]。中性粒细胞和嗜酸性粒细胞可通过分泌IL-22以及利用免疫球蛋白-A(IgA)激活适应性免疫应答，在先天免疫中发挥作用。树突细胞(Dendritic Cells，DCs)或上皮细胞产生的细胞因子可使先天性淋巴样细胞激活，其中表达核孤儿受体γ的3型先天淋巴细胞(Type 3 Innate Lymphoid Cells，ILC3)被IL-1、IL-6和IL-23激活，使其联合共生菌产生效应细胞因子IL-17/IL22[10]。ILC3还具有诱导上皮细胞产生黏液和抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)的能力。此外，ILC3通过产生粒细胞巨噬细胞集落刺激因子直接影响适应性免疫应答反应，导致了调节性T细胞的产生[11]。细菌定殖诱导T辅助细胞17(T helper 17，Th17)产生能够控制肠道细菌的IL-17，IL-17通过刺激上皮细胞产生的AMPs可募集中性粒细胞以及促进IgA的分泌[12]。肠道内的免疫反应随细菌密度而变化，并且取决于菌群类型。调节先天免疫系统和适应性免疫系统中最重要的细菌是与梭菌相关的分段丝状细菌(segmented filamentous bacteria，SFB)，主要黏附于上皮表面和Peyer′s斑块以获取营养[13]。肠道菌群除在肠道免疫系统中的作用外，还对菌群外周环境有间接影响。虽然这些机制尚不明确，但已有证据表明肠道菌群可通过细菌及其代谢产物中可溶性因子的扩散产生外周效应[14]。

1.4 病原体防护

肠道菌群在防止病原体定殖肠道方面起着至关重要的作用，共生微生物群和细菌病原体在肠道定殖的微环境一致。共生细菌能够产生特异性抑制同种细菌的菌素和毒素，其中由人和不同动物分离出几种共生大肠埃希菌(Escherichia coli)菌株所产生的细菌素可抑制致病性肠出血性E. coli的生长[15]。同样，一些共生菌产生的SCFAs可以通过改变pH值对某些病原体如沙门氏菌产生毒性作用[3]，SCFAs尤其是丁酸盐，已被证明可通过下调沙门氏菌致病岛1基因的表达来抑制沙门氏菌的毒性，从而限制该病原体对上皮细胞的侵袭[16]。抵抗病原体共生的一种防御方式是通过病原体相关分子模式或含有脂多糖、脂质A、鞭毛、细菌DNA和RNA这些菌群组分的微生物相关分子模式激活宿主先天免疫。MyD88-/-小鼠体内Paneth细胞在小肠中产生AMPs减少，导致肠系膜淋巴结中共生细菌的定殖增加，也致使沙门氏病原菌向脾脏中的传播增加[17]。有研究表示，革兰阴性拟杆菌和革兰阳性乳酸杆菌这几类共生细菌通常能产生AMPs，其AMPs家族中分泌的C型凝集素的RegⅢ-γ在mRNA水平表达显着增加[18]。Ivanov等[19]发现当小鼠单独定殖共生菌SFB时能够诱导肠黏膜固有层中的Th17细胞产生其效应因子IL-22和IL-17。SFB联合病原菌柠檬酸杆菌定殖的小鼠可明显减少病原菌的侵袭能力。

2 肠道菌群引发肠癌原因

2.1 细菌来源的基因毒素和其他细菌毒力因子

在生物个体系统发育进化过程中，细菌逐渐获得了具有致病性的毒素。例如，细菌发展了特别是通过使用鞭毛、菌毛和黏附素来穿透肠黏膜屏障的能力，以及黏附和侵入肠上皮细胞的能力，病原体对大多数疾病促进和致癌作用依赖于这些毒素。 病原体可与黏附分子相互作用，核梭杆菌利用FadA毒力因子黏附和侵入细胞，从而激活β-catenin信号通路并引发CRC[20]。调节真核细胞周期的细菌毒素(Cyclomodulins)，包括细胞致死毒素(Cytolethal distending toxin，CDT)、黏菌素、细胞毒性坏死因子和周期抑制因子，可诱导DNA损伤，干扰细胞周期及细胞凋亡[21]。CDT可促发菌群肠道定殖并诱导促炎分子NF-κB、肿瘤坏死因子、IL-6和环加氧酶2的产生从而参与致癌过程。黏菌素是另一种细菌基因毒素，其合成和活化需要复杂的机制，黏菌素诱导活性氧(Reactive oxygen species，ROS)形成，DNA双链断裂，以及细胞周期停滞和基因组不稳定[22]。此外，产生黏菌素的E.coli可促使上皮细胞分泌生长因子并通过浸润细胞分泌促肿瘤分子来刺激肿瘤细胞增殖[23]。

2.2 微生物源代谢的致癌作用

影响CRC发生发展的因素除了细菌毒素外，菌群代谢致癌的作用也越来越明显。高脂肪饮食与胆汁分泌增加可促进CRC风险，这些酸不仅为菌群提供一定能量，同时也可参与CRC发展的相关过程，如细胞凋亡、增殖、DNA损伤诱导和肿瘤恶化[24]。小鼠模型中暴露于胆汁酸的肠道，其肿瘤的发生率较高[25]。细菌转化的胆汁酸可以通过产生促氧化分子，如ROS和氮物质(NOS)导致DNA损伤。因此，长期接触二级胆汁酸可诱导DNA损伤，导致基因组不稳定，此外，胆汁酸可使肠道菌群组成显著改变，其中与CRC发生密切相关的γ变形菌与拟杆菌数量会相对增加。一些致癌物质在肝脏中通过葡萄糖醛酸的介导而失活，并通过胆汁排泄至消化道。在肠道中，特别是在结肠中，该过程由于细菌β-葡糖醛酸糖苷酶的活化而逆转，并导致CRC的发生。CRC大鼠模型中肿瘤数量的减少与细菌β-葡萄糖醛酸酶活性被抑制有密切关系[26]。此外，较健康样本，CRC患者的粪便中存在更多具有活性的β-葡萄糖醛酸酶[27]。

2.3 免疫调节与慢性炎症

肠黏膜构成了对抗肠道微生物的第一道防线，维持肠道稳态涉及多种先天免疫受体，例如Toll样受体(TLR)和Nod样受体(NLR)，这些受体介导激活下游MAPK，NF-κB或PI3K/AKT信号通路[28]，并诱导多种细胞因子表达，例如TNF-α、IL-6、IL-8，增强炎症反应。目前已确定，具有增加的CRC发生风险的炎性肠病患者肠道菌群平衡会发生改变[29]，由肠道稳态失调所引起的炎症与肠癌发生密切相关。体内实验表明，肠道菌群的改变可引起肠癌治疗过程中肠道稳态的变化[30]。在CRC发生发展过程中，肠道炎症也可能与肠道细菌诱导的宿主免疫反应有关[31]。感染粪肠球菌的CRC小鼠模型中肿瘤和结肠黏膜免疫细胞浸润增强 TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8 的表达上调[32]。E.coli是与炎症性肠病相关的特征性细菌之一，其在炎症性肠病患者肠黏膜的定殖异常，并可诱导巨噬细胞环氧合酶2(COX-2)表达，参与结直肠癌发生中的肠道炎症反应[33]。

2.4 菌群参与CRC信号通路

肠道菌群对肠道免疫系统的稳态具有深远的影响。目前已有大量文献提示菌群组分既可以引发炎症，又可调节肠固有层内的免疫细胞[11,24,33]。同时肠道的正常发生发展过程会受到菌群的影响，正常肠道中隐窝中肠干细胞常常会受菌群内毒素等物质的刺激发生不可控的增殖反应，如当受到环氧合酶COX-2的激活或者生长因子15-PGDH的抑制将引发MMR(MLH1、MSH2、MSH6)上调以及APC和β-catenin的下调，肠道上皮开始增生，直至形成腺瘤时CIN、KRAS和BEAF受到影响，当TGF-β、MAPK等信号通路被抑制时，伴随PTEN缺失及PIK3CA的上调，同时TP53、BAX、SMAD4和TGFBR2等下调激活肿瘤细胞增殖。

CRC中由EGFR介导的主要信号通路为RAS-RAF-MAPK与PI3K-PTEN-AKT，两条通路激活均可引起细胞增殖，抑制凋亡。目前已明确的耐药机制，无论是信号分子突变(RAS、RAF、PI3K)还是旁路受体扩增(MET、HER2)，尚不能完全阐明抗EGFR靶向治疗中原发与继发耐药产生的原因。更为关键的是耐药一旦形成，菌群所引发的信号通路可以避开抗EGFR靶向药物的封闭作用而活化，患者往往不能继续从抗EGFR靶向治疗中获益。

2.5 氧化应激

氧化应激的定义是活性氧分子(ROS和NOS)水平与抗氧化防御功能之间的平衡失调，导致由活性氧分子介导的不可逆的细胞损伤，包括DNA断裂、突变、蛋白质聚集或降解，以及细胞膜功能障碍。ROS的产生在CRC的发生发展中具有重要作用，ROS可以在感染和炎症期间的细胞产生，或直接由肠道菌群产生。受感染细胞诱导ROS产生是肠道主要防御机制之一，有助于清除细菌[34]。体内体外实验表明，一些肠球菌属物种可产生羟基自由基等活性氧物质[35]，可导致DNA断裂，点突变及蛋白质-DNA交联，增强CRC相关基因不稳定[36]。幽门螺杆菌通过诱导氧化应激致胃癌发生已得到明确证实[37]，幽门螺杆菌能通过诱导免疫细胞产生ROS，影响细胞中的许多信号通路，从而促进胃癌发生。细菌及炎症诱导中性粒细胞和巨噬细胞的募集，这些炎性细胞是ROS的主要来源，参与肠癌发生过程中表观遗传改变[38]。肠道菌群还能促进宿主产生一氧化氮及NOS的产生，可以诱导DNA损伤[39]。

3 肠道菌群与肠癌防治

3.1 肠癌预防

小鼠和人类模型中已有很多研究证实调节肠道菌群可以预防CRC发生和进展，这其中涉及多种机制，通过体内体外实验表明体外益生菌移植可通过竞争作用减少致病性肠道菌群，同时也可以改变肠道内多种酶的活性，并减少肠道内致癌性胆汁酸，增加SCFAs产量[40]。体外实验表明肠道菌群移植可以有效减少肠黏膜DNA损伤，并有助于维持肠道屏障功能[41]。肠道菌群移植可以不同程度缓解CRC相关癌前病变，对肠癌及息肉切除术患者给予富含低聚果糖、鼠李糖及乳酸双歧杆菌Bb12[42]，经过12周的干预，取组织活检进行生物标记测试、毒性分析发现移植菌群有效抑制了肠黏膜增殖，肠道细胞坏死明显减少，上皮屏障功能得到改善。通过对样本进行分析发现，接受干预患者体内干扰素γ明显升高，多种原癌基因表达下调[43]。

3.2 缓解肠癌治疗不良反应

动物实验证实，肠道菌群移植可以有效减轻癌症治疗的不良胃肠道影响。当实验小鼠腹腔注射5-FU可引起腹泻症状，肠道益生菌悬液干预小鼠症状有所改善。进一步研究表明，受试小鼠肠绒毛损伤减少，肠道组织中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达减少[42]。另一项研究中，给予益生菌干预由伊立替康引发受试小鼠的体重减轻及腹泻等不良反应明显缓解，组织学检查发现其肠黏膜损伤明显减轻[44]。对接受伊立替康治疗的CRC患者进行多种肠道菌群移植，结果表明接受菌群移植的患者严重腹泻频率降低，止泻药物的使用明显减少[45]。另有临床试验评估了150名接受5-FU治疗的CRC患者中，化疗期间接受鼠李糖乳杆菌治疗的患者的死亡率降低，4级腹泻的发生率下降，腹部不适减少，同时接受干预患者化疗剂量也明显减少[46]。菌群移植也可减少放射治疗副作用。研究表明，肠道菌群与辐射损伤程度相关，可促进肠黏膜修复的作用[47]。同时也可作为手术辅助治疗，对168名术后CRC患者进行评估的研究中发现，接受益生菌干预患者与安慰剂组相比术后主要并发症的发生率显著降低[48]。

3.3 肠道菌群影响CRC治疗效果

临床癌症治疗研究中发现，某些患者受益于特定的治疗方案，而其他具有相似流行病学和临床特征的患者则不会。CRC患者肠道菌群可在接受治疗过程中发挥重要作用。最近的一项体外研究表明，植物乳杆菌可调节5-FU耐药肠癌细胞中某些癌症特异性标志物(CD44、133、166和LDH1)的表达，联合使用植物乳杆菌和5-FU对细胞进行干预可促进Caspase诱导的细胞凋亡，Wnt信号通路失活，进而增强5-FU的抗肿瘤作用[49]。另外，肠道菌群与肿瘤免疫治疗效果密切相关[50]。虽然目前这些研究的结果不能直接应用于临床，但可明确许多癌症治疗的有效性可能部分依赖于菌群的功能。由此可以推测，某些抗生素的使用可能会减弱抗癌药物的效果。

4 展 望

目前人们对微生物群体的认识还停留在比较初级的认识阶段，即使菌群对人类健康至关重要，但无法确定“健康”的人类菌群外观。某些功能，如调节免疫系统和肠道黏膜屏障是有益的，但事实上还有大量关键的菌群功能尚未被发现。

通过调节肠道菌群方式可以对肠道、免疫系统和菌群间的交互产生重要的影响，且肠道菌群的代谢行为可产生SCFAs，抑制产生毒素的病原体，抗增殖活性，减少异常隐窝病灶同时增强抗氧化酶的产生来对CRC产生保护作用。此外，也应考虑鉴定与临床或菌群相关的其他微生物作为预测免疫疗法反应的生物标志物。

当肠道黏膜存在炎症或破损时，黏膜细胞表面的受体蛋白、黏膜组织的渗透性发生改变，已吞噬细菌的巨噬细胞和已识别代谢产物的DCs无法将信号因子传递给嗜中性粒细胞，TNF-α或ROS无法被诱导，炎症细胞无法被杀死，从而引发促炎因子的过表达，激活信号转导子与转录激活子促进IL-17的分泌，继而造成免疫反应促使肠道癌变，导致动物肠腔内皮增生、IL-18过表达。菌群在肠道内对肠道细胞各信号通路中的蛋白影响甚多，如MAPK中的ERK2、JNK及p38a蛋白水平在不同菌群影响下会出现表达量的显著差异。针对菌群的大部分研究都是在动物模型中进行的，而来自人类的临床试验研究数据，迄今为止结果仍不一致。

综上所述，肠道菌群与CRC发生发展之间的相关性日趋明确，为CRC的预防与治疗提供了新的研究方向。评估肠道微生物组的研究表明，其与结直肠癌的发病机制和治疗之间存在紧密的联系。有必要在人类受试者(如粪便移植实验)中进一步进行转化研究和临床试验，以操控微生物组改善结直肠癌患者预后的可能性。