潮州市市售豆制品的转基因成分检测

迄今为止，中国批准了转基因棉花、番木瓜大规模商业化生产，市场上流通的绝大部分转基因大豆是进口而来的[1]。2019年12月，中华人民共和国农业部已经批准上海交通大学研发的转基因大豆的生物安全证书，但是转基因大豆大规模的商业化种植还需要一段时间。我国对于转基因食品的风险规制还没有将监管重心放在食品之上，而是放在作为原料来源的转基因生物上[2]。进口转基因大豆具有价格优势，为了降低生产成本，生产厂商会选择购买进口转基因大豆作为加工原料。由于大多数市售豆制品是散装的，没有食品标签，因而不易追踪到制造源头[3]，增加了市场上的转基因食品的监管难度。我国《转基因食品卫生管理办法》等都明确规定了，若销售的食品含有转基因成分，应该予以标识。2019年新版中华人民共和国食品安全法明确规定，生产经营转基因食品应当按照规定显著标示。转基因食品标识制度可以规范和约束转基因食品市场，对于尊重消费者的知情权和选择权，具有重要的现实意义。不同消费者群体对转基因食品的客观认识存在一定的局限性，也对转基因食品的健康风险的认识是不相同的。这表明，转基因作物在中国的商业化依赖于消费者对转基因食品信息的掌握和理解以及严格的转基因食品的安全监管措施[4]。

法律法规是转基因食品市场监管的依据和支撑，同时，转基因食品的检测技术手段是行之有效的辅助措施。豆制品的转基因成分的检测依赖于检测样品DNA的高质量提取，由于大豆及豆制品中含有较多的多糖、酚类物质，提取DNA时需去除这些物质对聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的干扰[5]。国内外研究中，主要利用试剂盒来提取豆制品中的DNA，研究结果表明改良的CTAB法相比较其他方法更为简单和高效[6,7]。转基因产品的检测原理有二：一是检测遗传物质中是否含有插入的外源基因；二是通过插入外源基因表达的蛋白质产物或其功能进行检测，或是检测插入外源基因对载体基因表达的影响，主要检测外源基因对插入位点附近基因影响及对其代谢产物的影响[5]。对于大豆或豆制品中的转基因成分的检测方法，国内有的采用田间表型鉴定和 PCR检测相结合的方法，或者用抗草甘膦基因CP4-EPSPS及其表达元件的 Real-time quantitative PCR检测法检测豆制品中转基因大豆成份[7,8]。目前国际上还没有统一的针对深加工转基因产品的标准化检测方法，综合各国的检测方法，主要有两类技术：基于特异性DNA片断的PCR检测技术和基于特异性蛋白质的免疫学检测技术ELISA法和试纸条法[9]。其中PCR检测法有定性PCR和定量PCR；定性PCR主要有多重PCR、巢式和半巢式PCR；定量PCR主要有竞争定量PCR和实时荧光PCR等方法[10]，而荧光定量 PCR在转基因产品检测上已得到广泛应用[11]，具有特异好、灵敏度高、扩增效率高和高通量的优点。

检测与分析潮州市市售豆制品中的转基因成分，可以对潮州市市售豆制品使用转基因大豆制作豆制品的状况有一定的了解。本次实验主要采用改良十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取豆制品基因组DNA，采用核酸定性PCR、实时定量PCR对外源基因CaMV35S，NOS和CP4-EPSPS进行双重检测[3]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 样品

我们采集的样品是来自于潮州市区南门市场、北门市场、粤潮市场、西新市场、上东平市场、卧石市场、社光市场、奎元市场、桥东市场等8个主要市场以及潮州大润发超市的市售豆制品。其中，大润发超市的还有豆浆、豆干、千张这3种豆制品。大豆制品待检样品来源如表1。

表1 大豆制品待检样品来源信息一览表
Table 1 Source information list of soybean products for inspection

表2 PCR引物及其反应条件参数
Table 2 PCR primers and parameters of reaction conditions

1.1.2 试剂和试剂盒

DNA marker：Ladder H2（50～1031 bp），购自Takara公司；Biowest Agarose琼脂糖粉，购自北京沃比森科技有限公司；50×TAE缓冲液，购自碧云天生物技术有限公司；核酸定性PCR反应试剂，购自Takara公司；四对正义引物与反义引物（CP4-EPSPS 02 r/f、Lectin 02 r/f、CaMV35S r/f、NOS r/f），购自生工生物工程股份有限公司；定量PCR反应试剂，购自Takara公司；超纯水；柱式深加工产品基因组DNA抽提试剂盒，购自生工生物工程股份有限公司。

1.1.3 仪器与设备

台式高速冷冻离心机，购自济南福的公司；迷你离心机，购自其林贝尔公司；恒温水浴锅，购自江苏科析仪器有限公司；荧光实时定量 PCR仪器 Light Cycler 96，购自罗氏公司；常温冰箱，青岛Haier公司；超微量分光光度计，购自上海元析仪器公司；优普 UPH系列标准型超纯水机，西安优普仪器设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大豆基因组DNA提取

（1）制取样品：固态产品，用去污染的手术刀片挑取一块豆腐/千张/豆干并切碎，称取200 mg于2 mL离心管中；液态产品，吸取50 μL的豆浆于2 mL离心管中；

（2）向上述含有材料的离心管中加入 GMO Buffer 500 μL proteinase K 10 μL，加入10 μL 的10 mg/mL RNAase（获得无RNA污染的基因组DNA），注意食品材料需要完全浸没在GMO buffer中才能保证充分裂解。充分振荡混匀后，65 ℃水浴30 min，期间注意要进行颠倒振荡混匀；

（3）水浴后用离心机 12000 r/min转速离心 10 min，吸取300 μL左右的上清液到新的2 mL离心管中；

（4）往上清液中加入200 μL氯仿后充分混匀，用离心机12000 r/min转速离心10 min，吸取200 μL上清液转移到新的离心管；

（5）向上清液加入400 μL的GMP Buffer，充分混匀，静置5 min（提高基因组DNA的得率），用离心机12000 r/min转速离心5 min后将上清液弃掉；

（6）向沉淀中加入350 μL DRL Buffer，将沉淀物充分悬浮起来；

（7）接着加入30 μL无水乙醇，充分混匀后将液体全部转移到吸附柱中，在室温静置 2 min，用离心机10000 r/min转速离心2 min，将收集管中的溶液弃掉；

（8）吸附柱中加入500 μL Wash Solution，用离心机10000 r/min转速离心1 min，将收集管中的溶液弃掉。重复步骤（8）1次；

（9）将吸附柱放回收集管中，用离心机 12000 r/min转速离心2 min；

（10）将吸附柱取出，放入一个新的离心管中，吸取50 μL TE buffer（先在60 ℃预热）加入到吸附膜中央，静置3 min，12000 r/min离心2 min，最后将提取出的DNA溶液放置在-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2 大豆基因组DNA的OD值检测

用核酸蛋白分析仪测量OD值，在波长为260 nm和280 nm处对DNA样品的吸光度进行测量。μg级纯度的DNA样品可以通过A260测定法进行定量，即50 μg/mL的双链DNA质量浓度等同于1个A260的OD值。A260/A280即在波长260 nm和280 nm处的吸光度的比值能够用来指示DNA的纯度，纯度高的DNA样品A260/A280在1.8左右，当A260/A280比值大于1.8时，说明样品中还有RNA没有除尽，依旧有RNA残留；若A260/A280比值小于l.7，表明样品中受到酚或蛋白质的污染，倘若OD260 nm/OD280 nm比值介于1.8～2.0之间，DNA质量浓度达到每微升200纳克，则基本能够进行PCR检测[3,5]。

1.2.3 核酸定性PCR检测

将提取到的大豆基因组DNA进行核酸定性PCR检测，分别对外源基因CP4-EPSPS、NOS和CaMV35S和内源基因Lectin进行扩增，引物参数如表2。核酸定性PCR扩增体系（20 μL）如下：2×SGExcel SYBR：10 μL；正义引物：0.5 μL；反义引物：0.5 μL；DNA模板：9 μL核酸定性PCR引物序列，反应循环参数如表2所示。PCR扩增完成后，用1×TAE电泳缓冲液制备2%的琼脂糖凝胶（等凝胶融化后冷却到60 ℃左右时加入溴化乙锭）。将PCR扩增产物（5 μL）与上样缓冲液6×Loading Buffer（1 μL）按比例均匀混合，然后分别加入对应的凝胶孔中，同时加入1 μL DNA分子量标记物Ladder H2（50～1031 bp）和相应的DNA样品，将电压调至90 V进行电泳30 min。用凝胶成像分析系统进行观察分析并记录结果[11]。CaMV35S目的基因片段为195 bp，NOS目的基因片段为180 bp，CP4-EPSPS目的基因片段为320 bp，Lectin目的基因片段为438 bp。

1.2.4 实时定量PCR检测

提取到的大豆基因DNA进行实时实时定量PCR反应，分别对外源基因CP4-EPSPS、NOS和CaMV35S进行扩增。实时定量PCR引物序列，反应体系如下：PCR反应体系为20 μL，其中Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，探针0.5 μL，模板DNA 2 μL，用灭菌超纯水补齐至20 μL。空白对照以超纯水代替模板DNA。PCR扩增反应条件以及引物序列、探针等参照中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1195-2003《大豆中转基因成分的定性PCR检测方法》[12]。

1.2.5 数据处理

实验数据以实测有效数值来表示，对不同样本的实测有效数值进行归一化处理后进行分析。

2 结果与讨论

2.1 大豆基因组DNA的OD值

本次实验的检测样品均为常见的豆制品，其加工过程简单、含油量低，因此基因的破坏程度很低，而且提取效果好。利用食品级改良CTAB法提取所有豆制品样品基因组的DNA，这是转基因国际标准草案推荐的方法[13]。在提取前，对样品做预处理，在不破坏基因组、不受污染的情况下，充分研磨样品，有助于样品与抽提试剂更充分接触，可获得浓度、纯度更高的DNA抽提溶液。由表3可知所有抽检样品的大豆基因组的DNA都成功提取，所得DNA溶液浓度和纯度都较高，抽提效果比较理想，DNA质量浓度达到200 ng/μL以上，OD260 nm/OD280 nm介于1.9～2.1之间，说明有少量的RNA尚未除尽。虽含有少量RNA，但RNA为检测结果影响很小，可忽略不计。抽取到的DNA质量浓度基本能满足转基因成分的检测需要。

核酸定性检测，是常见的检测方法，其结果客观可靠。只要在凝胶成像分析系统中观察，观察是否存在特异性条带，即可判断是否含有转基因成分。根据扩增基因在凝胶上出现的条带，由表4和PCR扩增凝胶电泳图可知，在保证含有Lectin基因的基础下，以三种引物CaMV35S、NOS、CP4-EPSPS扩增所有样品。其中含有CaMV35S外源基因的样品数量有11份，含有NOS外源基因的样品数量有3份，含有CP4-EPSPS外源基因的样品数量有3份。含有CaMV35S外源基因的样品数量较另外两种外源基因成分多，综合可得所检测的所有市售豆制品转基因比率为37.93%，与后续的定量PCR法检测相比，阳性结果少。黄靖等人所采用实时荧光 PCR法得到的腐竹和腐乳的阳性比率均高于核酸定性PCR法[3]。通过分析可能存在的原因后，我们认为，可能是由于提取出来的外源基因含量过低、零碎，导致特异性亮带不明显；也可能是由于操作、环境问题等原因所造成假阴性。

表3 大豆基因组DNA的OD260 nm/OD280 nm及核酸浓度
Table 3 OD260 nm/OD280 nm and nucleic acid concentration of soybean genomic DNA

表4 市售豆制品核酸定性PCR转基因检测结果
Table 4 Qualitative PCR detection of genetically modified nucleic acids in commercial soybean products

2.2 核酸定性PCR检测结果分析

共检测市售豆制品29份，通过核酸定性PCR进行转基因检测的结果如表4所示。散装市售豆制品外源基因的核酸定性PCR扩增结果图1所示。

图1 豆制品外源基因核酸定性扩增结果
Fig.1 Qualitative amplification of exogenous gene nucleic acid in soybean products

注：从左到右，依次为M：Marker；1：样品DNA；2：以CP4-EPSPS引物扩增的样品；3：以Lectin引物扩增的样品；4：以CaMV35S引物扩增的样品；5：以NOS引物扩增的样品。(i：nanmen005；ii：nanmen006；iii：nanmen007；iv：beimen001；v：beimen002；vi：beimenhong001；vii：yuechao001；viii：yuechao002；ix：yuechao003；x：yuechao004；xi：yuechao005；xii：xixin001；xiii：xixin002；xiv：xixin003; xv：xixinhei001; xvi：shangdongping001; xvii： shangdongping002; xviii：shangdongping003; xix：woshi001; xx：woshi002; xxi：sheguang001；xxii：sheguang002；xxiii：qiaodong001；xxiv：kuiyuan001；xxv：darunfa001；xxvi：darunfadoujiang；xxvii：darunfadougan；xxviii：darunfaqianzhang；xxix：darunfadoufu)。

根据核酸定性扩增结果可知，如表4所示，市售豆制品转基因比率为37.93%，CaMV35S检出数量比例为11/29，而NOS和CP4-EPSPS的检出数量均为3/29。实验结果说明外源转基因成分CaMV35S的DNA结构完整性，在大豆基因组DNA 制取过程中保存较好，这对于检测豆制品中转基因成分是有利的。同时说明豆制品转基因成分检测，核酸定性分析法还是存在方法学上的缺陷，必须借助其他手段如实时定量PCR法，才能准确地检测豆制品中转基因成分存在与否以及样品中非豆制品成分的干扰等。

表5 市售豆制品定量PCR转基因检测结果
Table 5 Results of quantitative PCR of soybean products in the market

2.3 实时实时定量PCR检测结果分析

共检测市售豆制品29份，通过实时实时定量PCR进行转基因检测[14]的结果如表5所示。散装市售豆制品外源基因的实时定量PCR扩增结果图2所示。

图2 豆制品实时定量PCR外源基因扩增结果
Fig.2 Real-time quantitative PCR amplification of exogenous genes in soybean products

注：a：Lectin基因实时定量PCR图谱；b：CaMV35S基因实时定量PCR图谱；c：NOS基因实时定量PCR图谱；d：CP4-EPSPS基因实时定量PCR图谱。红色方框所示为扩增后没有该基因的样品。

为了更为准确地检测样品中含有转基因成分的比例，我们采用了灵敏度较高的实时定量PCR[13]，该法很好地克服由于外源转基因成分含量低、结构破碎造成的假阴性结果。实验体系严格按照中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1202-2010《食品中转基因植物成分定性PCR检测方法》[15]，并设置好空白对照、阳性对照。在确保空白对照Cq值大于40、阳性对照 Cq值小于或等于 34的前提下，以三种引物CaMV35S、NOS、CP4-EPSPS扩增所有样品。由图2可知，29份样品中，有2份未检测到有NOS基因，有9份未检测到CP4-EPSPS基因，可知其中10份样品中没有转基因成分，综合分析可知，我们所检测的潮州市市售豆制品转基因比率为65.52%。与此同时，含有 CaMV35S外源基因的样品数量较另外两种外源基因成分多，与核酸定性检测结果存在一致的关联性。不同的是，实时定量PCR法得到的市售豆制品转基因比率为65.52%，较核酸定性结果（37.93%）较高，必须考虑是由于人为操作等问题所造成的假阳性结果。谢响明等人[13]（2004），根据送检的 4种大豆制品的CP4-EPSPS扩增结果为阳性，含有转基因大豆成分。黄靖等人[3]（2014）研究发现，广州市售豆制品 207份，其中散装豆制品的转基因比率为54.7%，抽取预包装豆制品的转基因比率为37.5%，表明转基因豆制品已有相当高的市场占有率。这与我们所检测转基因豆制品情况很相似，说明转基因大豆违规流入豆制品加工与销售等环节的事实是不可回避的，应该引起监管部门的重视。

3 结论

本次实验对潮州市市售豆制品抽取的 29份进行了检测，实验结果表明，豆制品转基因成分阳性率大于50%。本次随机抽取的样品来源于潮州市具有代表性的市场，除了少数购买的样品是采用正规包装并有食品标签，大多数样品是散装且没有任何食品标签，但是，所有样品豆制品都没有是否含有转基因成分的食品标识。由于进口的转基因大豆明显的价格优势，也存在市场对作为加工原料的转基因大豆销售环节缺乏有效的监管，导致一些制造商违规采用转基因大豆作为豆制品生产原料。导致进入市场流通领域的转基因大豆及其制品影响范围甚广。最为迫切的问题在于转基因大豆作为原料进口后并违规加工制成的散装食品应该如何监管，如何尊重消费者对转基因食品的知情权与选择权，这是转基因食品监管工作所要面对的现实问题。转基因食品标识制度的实施仍处于一个初始阶段，国家应该建立起强有力的市场监管机制。因此，我们必须高度重视转基因食品标识制度落实及其相应的市场监管工作。

参考文献

[1] 王军,吴聚兰,马艳琴,等.转基因大豆的食品安全性及发展对策[J].农产品加工(学刊),2013,20:52-54 WANG Jun, WU Ju-lan, MA Yan-qin, et al. Food safety and development strategies of genetically modified soybeans [J].Processing of Agricultural Products (Journal), 2013, 20:52-54

[2] 孙娟娟.转基因食品规制争议：放松规制与审慎规制[J].科技与法律,2017,5:67-76 SUN Juan-juan. The dispute on genetically modified food:deregulation or regulation with precaution [J]. Journal of Science, Technology and Law, 2017, 5: 67-76

[3] 黄靖,何敏恒,许喜林.广州市售豆制品转基因成分的检测与分析[J].中国酿造,2014,33(9):138-142 HUANG Jing, HE Min-heng, XU Xi-lin. Detection and analysis of genetically modified ingredients in soybean products in Guangzhou [J]. China Brewing, 2014, 33(9):138-142

[4] XU Ruo-mei, Wu Yan-rui, Luan Jing-dong..Consumer-perceived risks of genetically modified food in China [J]. Appetite, 2020, 147: 104520

[5] 孙梦梦,黄欢欢,沈晓芳,等.豆制品转基因检测中不同DNA提取方法的比较[J].江苏农业科学,2019,47(4):47-50 SUN Meng-meng, HUANG Huan-huan, SHEN Xiao-fang, et al. Comparison of different DNA extraction methods in genetically modified soybean products [J]. Jiangsu Agricultural Science, 2019, 47(4): 47-50

[6] 王澎,金丽晨,耿志明,等.食用大豆油中 DNA 的快速提取和转基因成分定性检测[J].江苏农业学报,2008,24(6):940-943 WANG Peng, JIN Li-chen, GENG Zhi-ming,et al. A method for DNA isolation from soy bean oil and qualitative detection of genetically modified organisms [J]. Jiangsu Agricultural Journal, 2008, 24(6): 940-943

[7] ZHAO, Ya-wei, Deng Hai-yan, Yu Chang-xin, et al. The Chinese public’s awareness and attitudes toward genetically modified foods with different labeling [J]. npj Science of Food, 2019, 3(1): 17

[8] 宋扬,吴存祥,侯文胜,等.对引进的美国大豆品种进行转基因成分的检测[J].大豆科学,2005,2:116-120 SONG Yang, WU Cun-xiang, HOU Wen-sheng, et al.Identification of the transgenic elements in the introduced America soy bean lines [J]. Soybean Science, 2005, 2:116-120

[9] Chang Bugil, Kim Jeong-Nam. Silent minority? Willingness to express opinions of motivated public depending on the perceived group size in the context of GM food controversy[J]. Public Relations Review, 2019, 45(5): 101786

[10] 蒋亦武,黄明,王保战,等.转基因大豆及制品中转基因成分检测技术研究进展[J].江苏农业科学,2011,1:345-348 JIANG Yi-wu, HUANG Ming, WANG Bao-zhan, et al.Advances in the detection of GM components in GM soybeans and products [J]. Jiangsu Agricultural Science, 2011,1: 345-348

[11] 许银叶,许佩勤,庄俊钰,等.实时荧光定量 PCR 技术检测腐乳中大豆转基因成分[J].江苏调味副食品,2019,2:33-35,44 XU Yin-ye, XU Pei-qin, ZHUANG Jun-yu, et al. Detection of soybean genetically modified components in fermented bean curd by real-time fluorescence quantitative PCR [J].Jiangsu Seasoned Non-staple Food, 2019, 2: 33-35, 44

[12] SN/T 1195-2003,大豆中转基因成分的定性PCR检测方法[S]SN/T 1195-2003, Qualitative PCR Detection of Transgenic Components in Soybean [S]

[13] 董流昕,谢响明,毛建军,等.大豆制品转基因成分检测和定量标识分析[J].植物检疫,2005,3:132-134 DONG Liu-xin, XIANG Xiang-ming, MAO Jian-jun, et al.Detection of soybean products of genetically modified components and quantitatively labeling analysis [J]. Plant Quarantine, 2005, 3: 132-134

[14] 陈彦,潘见,王亚,等.大豆DNA提取方法及降落PCR检测转基因成分的研究[J].食品科学,2009,30(24):355-358 CHEN Yan, PAN Jian, WANG Ya, et al. DNA extraction from soybeans and detection of genetically-modified components by touchdown PCR [J]. Food Science, 2009, 30(24): 355-358

[15] SN/T 1202-2010,食品中转基因植物成分定性PCR检测方法[S]SN/T 1202-2010, Qualitative PCR Detection of Genetically Modified Plant Components in Food [S]

Transgenic Analysis of Soybean Products Sold in Chaozhou City

WANG Mao-xian, XIAO Liang-yuan, WU Dan-xia, DENG Yu-ting, WANG Xin-yan
(School of Food Engineering and Biotechnology Hanshan Normal University, Chaozhou 521041, China)

Abstract: In order to understand the condition of genetically modified soybean products on the market in Chaozhou City, the soybean products in the main markets were randomly purchased for testing. The DNA components of soybean products were extracted by modified CTAB method, and OD values were measured by nucleic acid protein analyzer. The exogenous genes CP4-EPSPS, NOS and CaMV35S were detected by qualitative and real-time quantitative PCR. A total of 29 soybean products sold in the main markets of Chaozhou City were investigated and tested. The results showed that the concentration and purity of DNA extracted from soybean products were higher, OD260nm/OD280 nm ranged from 1.9 to 2.1, and the concentration of extracted DNA reached more than 200 ng/μL, which could basically meet the test requirements. More than half of the tested soybean products contain genetically modified ingredients. Except for Darunfa Supermarket’s soybean products, there are no food labels for soybean products, and whether GMF labels are required for all soybean products or not. The implementation of GMF labeling system is still in the initial stage, and a strong market supervision mechanism should be established in China.Therefore, we must attach great importance to the implementation of the GMF labeling system and the corresponding market supervision.